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Aclimatación de tres especies de leguminosas mediante bioendurecimiento con microorganismos benéficos

Melvin Maiquetía1 Edith Vargas1 Eva de García1 Marcia Toro2
1Universidad Central de Venezuela (UCV), Facultad de Ciencias, Instituto de Biología Experimental, Laboratorio de Biotecnología Vegetal, Caracas. Venezuela.
2Universidad Central de Venezuela (UCV), Facultad de Ciencias, Instituto de Zoología y Ecología Tropical, Laboratorio de Ecología de Agrosistemas, Caracas. Venezuela.
DOI

RESUMEN

Las semillas de Calopogonium sp., Stylosanthes capitata y Cassia moschata presentan un estado de latencia prolongada que limita su germinación. Una alternativa de propagación es por cultivo in vitro, y para mejorar la adaptación al ambiente terrestre se utiliza el procedimiento de bioendurecimiento. El objetivo de la investigación fue evaluar el efecto de inoculación con microorganismos benéficos en la aclimatación de esas tres especies de leguminosas. Se seleccionaron 16 plantas para cada tratamiento, de las tres especies obtenidas de germinación in vitro. Para su aclimatación se sembraron en un sustrato, en envases de 250 mL. Los tratamientos fueron: inoculación de hongos Glomeromycota (HMA), inoculación con hongos Glomeromycota y Rhizobium phaseoli (HMA + R), control sin microorganismos (SM). Se determinó la sobrevivencia en un periodo de cinco meses. Calopogonium sp. mostró un 16 % de sobrevivencia a los cinco meses y 85 nódulos.planta-1 para el tratamiento HMA+R y 40 % de colonización micorrízica en el tratamiento HMA, lo que favoreció su aclimatación. S. capitata tuvo un 25 % de sobrevivencia con HMA y mostró menor cantidad de nódulos (5 nódulos.planta-1) con HMA + R, e insuficiente cantidad de raíces para cuantificar la micorrización. C. moschata inoculada con HMA alcanzó 13  de sobrevivencia, sin formación de nódulos. La inoculación con microorganismos fue diferencialmente beneficiosa en la aclimatación de estas leguminosas y su efecto se potenció con la doble inoculación HMA+ R. La aclimatación de plantas obtenidas in vitro es vital para su establecimiento definitivo y es diferente para cada especie.

Palabras clave: Calopogonium sp., Cassia moschata, endurecimiento, micorrizas arbusculares, Stylosanthes capitata

Acclimatization of three legume species by biohardening with beneficial microorganisms

ABSTRACT

Calopogonium sp., Stylosanthes capitata and Cassia moschata are legumes whose seeds have high protein content and long dormancy. In vitro culture is used as an alternative of propagation. The procedure known as biohardening is used to improve plant adaptation to the terrestrial environment. The objective of the research was to evaluate the effect of inoculation with beneficial microorganisms in the acclimatization of these species of legumes. Sixteen plants from each of the three legume species obtained from in vitro germination were selected for each treatment. For their acclimatization, plants were sown on a substrate, in 250 mL containers. The inoculation treatments were: Glomeromycota fungi (AMF), inoculation with Glomeromycota and Rhizobium phaseoli fungi (AMF + R) and control without microorganisms (WM). After five months plant survival was determined. 16 % of Calopogonium sp. plants survived after five months, showed 85 nodules.plant-1sup>, for AMF + R treatment and 40 % mycorrhizal colonization in the AMF treatment, which favored its acclimatization. S. capitata showed 25 % of survival with AMF, showed fewer nodules (5 nodules.plant-1) with AMF + R and had insufficient roots to quantify mycorrhizal colonization. C. moschata inoculated with AMF reached 13 % survival and did not form nodules. The inoculation with microorganisms was differentially beneficial in the acclimatization of these legumes and its effect was enhanced with the double inoculation HMA + R. The acclimatization of plants obtained in vitro is vital for their definitive establishment and is different for each species.

Calopogonium sp., Cassia moschata, hardening, arbuscular mycorrhiza, Stylosanthes capitata

INTRODUCCIÓN

Las leguminosas constituyen un grupo de plantas de interés alimenticio, con importancia en la agricultura y pascicultura en diferentes países, donde se incluye Venezuela (De Pablos et al. 2009). Proveen una fuente sustancial de proteínas para el ganado, al utilizarse en sistemas silvopastoriles. Entre estas, Stylosanthes capitata Vogel y Calopogonium sp. que son subfrútices nativos de las sabanas y consumidos por el ganado durante la época de sequía (Pérez et al. 2006). Otra de las leguminosas es Cassia moschata Benth. que se utiliza como barrera viva en las parcelas de manejo agroecológico y suministro de nitrógeno al suelo (Toral et al. 2006). Estas especies se encuentran en ecosistemas de suelos ácidos, por lo que pueden mostrar limitaciones en su crecimiento.

En Venezuela, alrededor del 70 % de los suelos son ácidos, de baja fertilidad natural y con limitaciones para uso agrícola (López-Falcón y Espinoza 2015). La baja capacidad productiva de los suelos por manejos inadecuados, se aborda con el uso de altos volúmenes de fertilizantes inorgánicos nitrogenados y fosforados. Estos fertilizantes pueden ser retenidos en el suelo, con consecuencias eventuales de contaminación de los suelos y aguas (Sánchez et al. 2011). Es necesario implementar prácticas que promuevan la sustentabilidad del suelo, como el uso de microorganismos benéficos, las micorrizas arbusculares (MA) y las bacterias promotoras de crecimiento (Marinho et al. 2010). Estos, como biofertilizantes, constituyen un medio económico por la reducción de la aplicación de fertilizantes y favorecen el rendimiento de los cultivos, de manera amigable al ambiente.

La mayoría de las semillas de las Leguminoseae tienen como característica la impermeabilidad del tegumento, lo que les otorga la incapacidad de germinar de manera rápida (Anis et al. 2012). Esta característica, conocida como latencia, representa un mecanismo de super vivencia en climas desérticos o con alternancia de épocas secas y húmedas marcadas (Sanabria et al. 2004). Pueden tener, además, baja viabilidad y mediano porcentaje de germinación, lo que restringe su reproducción a gran escala (Rojas-Rodríguez y Torres-Córdoba 2015).

Debido a la latencia de las semillas de las Leguminoseae surge la necesidad de incrementar su propagación y conservación como recurso fitogenético (Escandón et al. 2003). Una alternativa de propagación es por medio de cultivo in vitro. Sin embargo, estas plantas presentan alteraciones morfológicas y fisiológicas que hacen de su aclimatación al exterior uno de los principales inconvenientes de la técnica. Con frecuencia, estas plantas poseen un escaso desarrollo de la cutícula foliar, hojas blandas y poco activas fotosintéticamente. La inactividad del aparato estomático, la pobre conexión vascular en el vástago y raíces poco funcionales, predisponen a estas plantas a una desecación inmediata al pasarlas a condiciones ex vitro (Pérez et al. 2006).

Para mejorar la adaptación al ambiente terrestre de las plantas producidas in vitro, varios autores han utilizado la inoculación con hongos Glomeromycota (Calderón et al. 2000) y bacterias promotoras de crecimiento (Singh et al. 2012, Muthuraj et al. 2018), procedimiento conocido como Bioendurecimiento o Biohardening (Singh et al. 2004). La inoculación de microorganismos benéficos genera efectos positivos, tanto en el incremento de la sobrevivencia de la planta, durante la fase de aclimatación, como en el desarrollo del sistema radical (Anis et al. 2012). Asimismo, las variables de crecimiento, densidad de raíces y colonización micorrízica mejoran en las plantas bioendurecidas (Fernández et al. 2002).

Las especies de la familia Fabaceae se destacan por su asociación simbiótica con las bacterias de la familia Rhizobiaceae o rizobios (Weir 2016). Estas bacterias tienen la capacidad de formar nódulos en las raíces, donde captan el nitrógeno de la atmósfera. Cerca de 3.400 especies de leguminosas se han analizado por su capacidad para nodular (Kumar et al. 2019).

Las especies de leguminosas se asocian a los hongos Glomeromycota u hongos formadores de la micorriza arbuscular (HMA) formando la simbiosis MA. Esto permite una mejor nutrición de la planta, principalmente, por favorecer la absorción del fósforo. Esas especies pueden tener doble simbiosis, rizobio-micorriza, lo que se conoce como simbiosis tripartita (Chalk et al. 2006); esto le confiere a la planta la capacidad de nutrirse de dos macronutrientes de importancia, como el nitrógeno (N) y el fósforo (P).

En los suelos agrícolas la asociación rizobio -leguminosa provee la fuente de N más importante para la planta (Liriano et al. 2012). Los simbiontes asociados son del orden Rhizobiales, que incluye varios géneros entre ellos Rhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Azorhizobium, Ensifer y Sinorhizobium (Datta et al. 2015). El nitrógeno atmosférico (N2) es fijado dentro de los nódulos por dichas bacterias y lo transforman en amonio (NH4), que emplea la planta como fuente asimilable para su crecimiento; ese proceso se denomina fijación biológica del nitrógeno (FBN) (Poole et al. 2018). El género Rhizobium es capaz de abastecer hasta un 90 % de las necesidades de nitrógeno en dichas plantas, a través de la FBN (López-Alcócer et al. 2017). Los rizobios son también considerados como rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal, colonizadoras del sistema radicular y su entorno más cercano, descritas originalmente por Zablotowicz et al. (1991).

La micorriza arbuscular es una simbiosis mutualista de amplia distribución en el reino vegetal (Barea 2015); favorece el crecimiento de la planta, ya que participa en la absorción de nutrientes inorgánicos de poca movilidad en el suelo, principalmente, el fósforo. Una abundante red de hifas del hongo que se extiende fuera de la raíz influye en la captación de los elementos de la solución del suelo. Esto permite que aumente la calidad y el rendimiento de los cultivos, se protegen las plantas de estreses bióticos y abióticos y mejora la estructura del suelo (Toro y Andrade 2020). Las micorrizas arbusculares son de interés biotecnológico, consideradas biofertilizantes. Su aplicación en sistemas agrícolas, prácticas de reforestación y recuperación de suelos contaminados o erosionados son promisorias (Toro et al. 2008).

El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto de la inoculación con microorganismos benéficos en la aclimatación de tres especies de leguminosas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal

En una primera etapa se realizó la propagación de las especies Calopogonium sp., S. capitata y C. moschata a partir de la germinación in vitro de semillas, según Maiquetía et al. (2020). Las plantas in vitro se extrajeron del medio de cultivo y se enjuagaron con agua destilada, para retirar el agar de las raíces. Se seleccionaron un total de 48 plantas por especie de leguminosa, con una altura de 4 a 6 cm, para el proceso de endurecimiento con microorganismos ó bioendurecimiento.

Microorganismos

El inóculo de HMA que se utilizó se multiplicó en el Laboratorio de Ecología de Agroecosistemas del Instituto de Zoología y Ecología Tropical, UCV. Es un cultivo mixto de hongos Glomeromycota nativos de los suelos de las sabanas de Santa María de Ipire, con predominio de especímenes per tenecientes a las familias Acaulosporaceae, Glomeraceae y Gigasporaceae (Mora et al. 2013). Se obtuvo mediante el uso de Zea mays como planta hospedera. El uso de inóculos mixtos, multicepa o consorcios de hongos Glomeromycota es una práctica que permite asemejar a las condiciones del suelo rizosférico de la planta, en su ecosistema natural. El inóculo (20 g.planta-1) consistió en una mezcla de esporas (600 esporas.g-1 suelo), raicillas colonizadas (67 % de longitud de raíz micorrizada, LRM) y micelio, y se cuantificó según Giovanetti y Mosse (1980) previa tinción con azul de tripan (Phillips y Hayman 1970).

También se empleó el inóculo de Rhizobium phaseoli (R) que pertenece a la colección de microorganismos del Laboratorio de Ecología de Agroecosistemas, según Mora et al. (2013). Este se multiplicó en el mismo L aboratorio. Es un simbionte de rápido crecimiento que posee un amplio rango de hospederos de leguminosas con diferentes grados de efectividad y afinidad (Lloret y Martínez-Romero 2005). Se añadieron 2,5 mL.planta-1 directamente en la base de la planta, a una concentración de 108 UFC.mL-1. El inóculo de HMA se aplicó para el tratamiento solo con micorrizas (Tratamiento HMA) y en combinación con R. phaseoli (Tratamiento HMA + R) al momento que se colocaron las plantas a aclimatar en el sustrato.

Diseño experimental

La investigación se realizó en el invernadero del Laboratorio de Biotecnología Vegetal del Instituto de Biología Experimental de la Universidad Central de Venezuela (UCV). El diseño experimental empleado fue de bloques al azar, con tres tratamientos de inoculación correspondientes a: control sin microorganismos (SM), inoculación de hongos Glomeromycota (HMA) e inoculación con hongos Glomeromycota y Rhizobium phaseoli (HMA + R) con 16 plántulas o repeticiones para cada tratamiento. Las plantas seleccionadas de las tres especies se trasplantaron a macetas, con capacidad de 250 mL; se colocaron en un sustrato constituido por una mezcla de suelo de sabana y tierra abonada (comercial) en proporción 2:1, cuya composición según Mora et al. (2017) fue: Textura: areno-francosa; pH= 5,01; N inorgánico= 20,36; P=11,32; K= 41,25; Ca= 57,63; Mg= 35,13; Na= 7,2 (mg.kg-1); Materia Orgánica= 1,33 %, CIC= 3,06 (cmol+.Kg-1). Las macetas con las plantas se ubicaron dentro de propagadores con alta humedad (80-93 % de humedad relativa) y baja luminosidad (10 μmol.m-2.s-1, densidad de flujo fotónico fotosintético, DFF), durante 21 días. Luego de este período, las macetas se retiraron del propagador y se colocaron en el invernadero, donde se evalúo su supervivencia, desarrollo y crecimiento, durante cinco meses. Las plantas se regaron cada tres días con agua destilada. Una vez por semana se regaban con 20 mL de solución Hewitt (1966) de acuerdo a cada tratamiento.

Sistema de muestreo y variables analizadas

Se realizaron medidas mensuales de altura de la planta (cm) y diámetro (mm) basal del tallo, número de hojas y área foliar. Se evaluaron mensualmente los porcentajes de supervivencia de las plantas en el invernadero, considerándose como 100 % la supervivencia de las 16 plantas por cada tratamiento de inoculación. A los cinco meses de crecimiento se cosecharon cuatro plantas por tratamiento, para determinar el área foliar específica (AFE= área hoja/masa seca hoja), la longitud radical, la biomasa seca de hojas, vástago y raíces. Previo a las evaluaciones se realizó un lavado con agua destilada y posterior secado del material a 60 °C durante 96 h. Se pesaron en una balanza analítica digital marca Adventure (Ohaus, China). Este procedimiento, planteado para las tres especies, solo se aplicó a Calopogonium sp. y S. capitata (Tratamientos HMA y SM). En el caso de C. moschata el número de plantas al final del período de observación fue insuficiente para realizar estas determinaciones. De las mismas plantas, se colectaron muestras de raíces y se fijaron con isopropanol hasta la cuantificación de la colonización micorrizica, empleando la metodología de tinción con azul de tripán propuesta por Phillips y Hayman (1970). Cada raíz se observó en su longitud total y se evaluó la presencia de las estructuras típicas de las MA, mediante el método de intersección de cuadrantes de Giovanetti y Mosse (1980). En el tratamiento inoculado con R. phaseoli (HMA + R), para cada especie, se realizó un conteo del número de nódulos formados en la raíz de cada una de las plantas. Con esto se expresó el número total de nódulos por planta y el número promedio total de nódulos por tratamiento. Estas mediciones se realizaron para cada especie de leguminosa.

Análisis estadístico

Se aplicó un análisis de varianza (ANOVA), de dos vías para los datos que presentaban distribución normal y homogeneidad de varianzas. Se consideró los factores tiempo e inoculación para las variables sobrevivencia y de análisis de crecimiento a través del tiempo. El ANOVA de una vía se aplicó para los análisis de biomasa y análisis de crecimiento puntuales. En todos los casos en que las medias de los tratamientos diferían significativamente se aplicó la prueba de Duncan para P<0,05. Para los análisis se utilizó el programa Statistic 5.5.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Sobrevivencia de las plantas de las tres especies de leguminosas en vivero

Las plantas de la especie Calopogonium sp. inoculadas con HMA +R mostraron la mayor sobrevivencia (16 %), respecto a los tratamientos HMA y SM (Figura 1A). En el caso de S. capitata se obtuvo un 25 % de sobrevivencia en las plantas micorrizadas (HMA), tratamiento con mayor supervivencia que SM y HMA + R (Figura 1B). En la especie C. moschata solo con el tratamiento HMA+R se mantuvo un 13 % de sobrevivencia de las plantas (Figura 1C).

Sobrevivencia plantas
Figura 1. Variación del porcentaje de sobrevivencia de plantas provenientes de semillas germinadas in vitro en la inoculación con HMA, HMA+R y SM sobre la sobrevivencia: A) Calopogonium sp., B) S. capitata y C) C. moschata (Letras distintas letras indican diferencias significativas entre tratamientos).

La mayor tasa de supervivencia se encontró en las plantas inoculadas con HMA (S. capitata) o la doble inoculación HMA + R (en los casos de Calopogonium sp y C. moschata). Resultados similares han sido descritos por Krishna et al. (2006) y Muthuraj et al. (2018), quienes indican que la mayor sobrevivencia de las plantas estaría favorecida por la mayor capacidad exploratoria de la raíz; por la red de micelio que la MA establece en la rizósfera, lo cual incide en una mejora de la toma de nutrientes y agua para la planta. Al interactuar las MA con R. meliloti, no solo se mejora la nutrición de P, sino también del N, lo cual estaría incidiendo en el mejor desarrollo de la planta en los tratamientos HMA + R (Meng et al. 2015). La interacción entre bacterias promotoras de crecimiento y las MA es sinérgica, estimulando la nutrición de las plantas; también se ha descrito que las bacterias promotoras favorecen la colonización micorrizica y por ende del desarrollo de la planta y adquisición de nutrientes (Mora et al. 2019).

Respuesta de crecimiento de las plantas de las tres especies de leguminosas provenientes de semillas germinadas in vitro

Calopogonium sp.

Se observó un incremento significativo en la altura de las plantas inoculadas con HMA+R y HMA respecto a las de control (SM), tendencia que se mantuvo hasta los cinco meses al finalizar la medición (Figura 2A). El diámetro basal del tallo fue mayor a partir del tercer mes en las plantas con doble inoculación (HMA+R), respecto a las plantas micorrizadas (HMA) y (SM), las cuales no tuvieron diferencias significativas entre sí a los cinco meses (Figura 2B). El número de hojas fue 46 y 28 % mayor en las plantas tratadas con HMA+R y HMA, respectivamente, en comparación a SM (Figura 2C). Es claro el efecto positivo de la inoculación con HMA + R en los parámetros de crecimiento de Calopogonium sp.

Raíz colonizada
Figura 2. Evaluación de variables de crecimiento: A) altura (cm); B) diámetro (mm) basal del tallo y C) número de hojas durante cinco meses, en plantas de semillas germinadas in vitro de Calopogonium sp. inoculadas con HMA, HMA+R y SM. Letras distintas indican diferencias significativas entre tratamientos.

La masa de los compartimientos foliar, tallo y raíz de las plantas de Calopogonium sp. mostró diferencias significativas entre los tratamientos de inoculación (Figura 3), resultando mayor el efecto de la doble inoculación (HMA+R). La mayor cantidad de masa puede deberse a la mejor condición nutricional que proveen las MA y a un posible realce de la función fotosintética, tal como indican Rupnawar y Navale (2000) en plántulas de granada y Decklerk et al. (2002) en plantas de banano bioendurecidas. En el caso de la masa del tallo, de raíz y hojas se encon- traron diferencias significativas entre las plantas con los tratamientos HMA+R y HMA y las plantas control (SM), evidenciando nuevamente el efecto positivo de la inoculación de los microorganismos en la masa de la planta. La relación vástago/raíz mostró diferencias significativas entre tratamientos para las vitro plantas de Calopogonium sp., resultando con mayor valor en el tratamiento SM. Este compor tamiento ha sido descrito como un efecto de estimulación en el desarrollo radical por los microorganismos beneficiosos descrito por Vidal et al. (1992) quienes obser van un menor desarrollo de la raíz en las plantas no inoculadas reflejado en una mayor relación V/R.

semillas germinadas
Figura 3. Efecto de la inoculación con HMA, HMA+R y Control (SM) en las plantas que provienen de semillas germinadas in vitro de Calopogonium sp. Letras distintas sobre las barras indican diferencias significativas entre tratamientos.

Tanto el área foliar total como el área foliar específica (mayor peso seco por unidad de área foliar) de Calopogonium sp. presentaron diferencias significativas entre tratamientos, resultando mayor el efecto positivo del tratamiento HMA+R, según se observa en la Figura 4. Tendencias similares fueron descritas por Vosátka et al. (1999) al conseguir buen desarrollo foliar y de la planta por efecto de la inoculación con varias especies de HMA, a consecuencia de la mejor condición nutricional (P y N) y a actividad fotosintética favorecida por las asociaciones simbióticas (Kumar et al. 2014, Mirjani et al. 2019).

Inoculación
Figura 4. Efecto de la inoculación con HMA, HMA+R, con respecto al control (SM) de plantas provenientes de semillas germinadas in vitro de Calopogonium sp. sobre el área foliar total y el área foliar específica. Letras distintas indican diferencias significativas entre tratamientos.

S. capitata

El tratamiento más favorable para la aclimatación de esta especie fue HMA, en el que se observó un incremento significativo en la altura de las plantas respecto a las SM, a partir del tercer mes de tratamiento que se mantuvo hasta el quinto mes, final de la medición (Figura 5). El diámetro basal del tallo y el número de hojas fueron mayores a partir del cuarto mes en las plantas inoculadas con HMA. En esta especie, la cantidad de raíces de las muestras finales fue insuficiente para cuantificar la colonización micorrízica. Sin embargo, se obser va que la inoculación con HMA favoreció los parámetros de crecimiento de S. capitata, coincidiendo con los resultados de bioendurecimiento con micorrizas de plantas micropropagadas obtenidos por Singh et al. (2012), Muthuraj et al. (2018) y Mirjani et al. (2019).

S.capitata
Figura 5. Evaluación del efecto de la inoculación de plantas de S. capitata, provenientes de semillas germinadas in vitro, durante 5 meses sobre: A) altura; B) diámetro basal del tallo y C) número de hojas. Triángulos, plantas inoculadas con HMA; cuadrados, plantas sin microorganismos inoculados (SM). Letras distintas indican diferencias significativas entre tratamientos.

Aunque las plantas de S. capitata, inoculadas con HMA + R, alcanzaron los mayores valores de sobrevivencia en la aclimatación, 63 % a los tres meses, estas no sobrevivieron hasta los cinco meses. Esto pudo ser causado por el desarrollo incipiente de las raíces y, posiblemente, de su aparato fotosintético, incidiendo en una fisiología disfuncional de las plantas y baja sobrevivencia (Kumar et al. 2014). Por esta razón no se realizaron mediciones de los parámetros de crecimiento para este tratamiento. Los microorganismos que se combinan o se mezclan pueden manifestar incompatibilidad entre ellos, dado que las interacciones mutualistas alcanzan inestabilidad debido a diversos factores bióticos y abióticos (Cano 2011).

C. moschata

Durante la etapa de aclimatación el número final (dos) de plantas de C. moschata fue insuficiente para obtener datos con significancia estadística sobre las variables estudiadas. Las plantas que se conservaron en el proceso mostraron buen vigor, buena apariencia, sin formación de estructuras nodulares. Investigaciones previas reportaron efectos beneficiosos de la inoculación micorrízica en árboles micropropagados (Singh et al. 2004); cuando se aplica la inoculación con HMA poco después de retirar los explantes de los vasos de cultivo y al comienzo del inicio de la raíz. Estas recomendaciones dependen de las especies, porque dicho beneficio no predominó en el presente estudio. Es conocido que la colonización micorrízica tiene lugar solo en raíces jóvenes y secundarias antes de la suberización (Azcón-Aguilar et al. 1992, 1997).

C. moschata es una especie arbórea de lento crecimiento y las raíces finas y jóvenes son producidas tardíamente durante el desarrollo ex vitro. Según los resultados de la presente investigación, puede ser que, el establecimiento de la simbiosis micorrizica haya sido más lento en esta especie afectándose su desarrollo y super vivencia. Así mismo, para el establecimiento de R. phaseolus y la formación de los nódulos, pues hasta cinco meses de crecimiento, no se observaron. Las características de lento crecimiento de esta especie arbórea así lo sugieren y concuerdan con los resultados de la presente investigación. El efecto beneficioso de la inoculación micorrízica en C. moschata parece ser confirmado por nuestros resultados en las plantas restantes, solo a nivel de crecimiento. Así mismo, podría haber casos en los que no se encuentren efectos significativos de la inoculación con hongos micorrizicos según la planta hospedera; por lo tanto, la combinación de planta-HMA debe probarse para cada cultivo en particular antes de iniciar el proceso de bioendurecimiento (Vosátka et al. 1999).

Las diferentes respuestas de aclimatación entre las especies de leguminosas pueden ser porque la rizósfera es un entorno dinámico, donde ocurren interacciones impor tantes entre planta-planta, planta-microorganismos y microorganismos-microorganismos. La respuesta de estas interacciones puede representar un posible antagonismo o sinergismo, el cual depende de las cepas microbianas implicadas en la interacción, así como, de la especie vegetal utilizada (Perez et al. 2015). Nuestros estudios continuarán evaluando estos aspectos a fin de optimizar los protocolos de bioendurecimiento para cada especie vegetal.

Cuantificación de la longitud de raíz colonizada por MA y nodulación en las raíces de las tres especies de leguminosas estudiadas.

En las plantas de Calopogonium sp. inoculadas con HMA se obtuvieron los mayores valores de colonización por micorrizas arbusculares (40±12 %). En el caso del tratamiento con HMA + R un 25±15 % (Cuadro 1), observándose vesículas y arbúsculos en la tinción de las raíces (Figura 6).

Raíz colonizada
Figura 6. Raíz de Calopogonium sp. proveniente de plantas semillas germinadas in vitro, durante cinco meses de aclimatación colonizada con HMA. Nótese la presencia de arbúsculos (A) y vesículas (V), estructuras típicas de la micorriza arbuscular.

Las plantas de Calopogonium sp. del tratamiento HMA + R exhibieron un promedio de 85 nódulos de R. phaseoli por planta, contrastando con las plantas, HMA y SM donde no se obser varon dichas estructuras, a pesar de ser un suelo no esterilizado. La ausencia de HMA y/o rizobios en dicho sustrato, efectivos o afines a las especies de leguminosas empleadas en este trabajo es evidente (Cuadro 1).

Cuadro 1. Colonización micorrizica (%) y número de nódulos en las raíces de las tres especies de leguminosas, inoculadas con microorganismos benéficos.
Variables Tratamientos por especies de leguminosa
SM HMA HMA + R
Calopogonium sp. Stylosanthes capitata Cassia moschata Calopogonium sp. Stylosanthes capitata Cassia moschata Calopogonium sp. Stylosanthes capitata Cassia moschata
Colonización micorrizica (%) 0 0 * 40 ± 12 * * 25 ± 15 * *
Número de nódulos 0 0 0 _ _ _ 85 ± 10,5 5 ± 3 0
SM: Sin microorganismos; HMA: inoculación de hongos Glomeromycota; HMA + R: inoculación con hongos Glomeromycota y Rhizobium phaseoli. Los valores son la media de n=4 + DS. Los valores de 0 en los tratamientos SM corroboran ausencia de hongos micorrízicos o rizobios en el sustrato utilizado. * significa que no hubo suficiente cantidad de raíces para determinar la colonización micorrizica ni número de nódulos. – No detectado.

Los resultados coinciden con los descritos por Meng et al. (2015), quienes señalan que la interacción de los rizobios con las MA es positiva para el crecimiento y desarrollo de las plantas; al igual que Chikkalaki et al. (2017), que obtuvieron eficiente bioendurecimiento de plantas de granada utilizando HMA y bacterias promotoras. Para Calopogonium sp., no hubo diferencias signif icativas respec to a la colonización micorrizica en la simbiosis tripartita, sin embargo se obser vó un número importante de nódulos por planta. Se ha descrito, Barea (2015), que la doble simbiosis es favorable en las leguminosas, reflejando una mejor condición nutricional y favorecimiento de los parámetros de crecimiento del tratamiento HMA + R. Un efecto similar de las inoculaciones se observa en la longitud de las raíces de esta especie (Figura 7).

Raíz colonizada
Figura 7. Efecto de la inoculación con HMA, HMA+R y SM sobre la longitud de raíz de plantas de Calopogonium sp. provenientes de semillas germinadas in vitro. Letras distintas indican diferencias entre tratamientos.

S. capitata no produjo suficiente cantidad de raíces para la determinación de la colonización micorrízica, sin embargo si hubo nodulación en el tratamiento HMA + R (Cuadro 1). Es claro el contraste entre las capacidades de nodulación y colonización micorrízica entre las tres especies estudiadas . Esto puede estar relacionado con las diferencias fisiológicas entre las especies y su afinidad con los microorganismos utilizados (Martínez-Viera et al. 2010). También se refleja en la ausencia de nodulación de C. moschata hasta los cinco meses de crecimiento, justificado anteriormente. En el mismo Cuadro 1, se obser va la ausencia de nodulación y colonización micorrizica para Calopogonium sp. y S. capitata en el tratamiento SM, corroborando la ausencia de los microorganismos utilizados en el sustrato empleado.

CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos ilustran un efecto promotor de la inoculación micorrízica y de bacterias promotoras sobre la aclimatación de plantas povenientes de propagación in vitro.

El uso de hongos MA efectivos es notable en el desarrollo eficiente de las plantas propagadas in vitro, reduciendo así la mortalidad durante la aclimatación, particularmente para Calopogonium sp. y S. capitata.

La aplicación de las micorrizas arbusculares y de R. phaseoli a las plantas de Calopogonium sp. favoreció su establecimiento y podría asumirse como una práctica rutinaria en la aclimatación de plantas de esta especie. En el caso de S. capitata y C. moschata, es necesario continuar con los estudios de optimización de los protocolos in vitro, de aclimatación y bioendurecimiento con otras especies de bacterias promo- toras y hongos micorrizicos; esto a fin de aumentar la super vivencia de las plantas de esas especies obtenidas in vitro, ya que la afinidad de los microorganismos puede variar con la planta hospedera.

LITERATURA CITADA

  1. Anis, M; Siddique, I; Naz, R; Rafique Ahmed, M; Aref, IM. 2012. Advances in micropropagation of a highly Impor tant Cassia species-A review (en línea). In Bandani, AR (ed.). New Perspectives in Plant Protection. p. 191-206. Consultado 13 jul. 2020. Disponible en https://bit.ly/2WxFKNk
  2. Azcón-Aguilar, C; Barceló, A; Vidal, MT; De la Viña, G. 1992. Futher studies on the influence of mycorrhizae on growth and development of micropropagated avocado plants (en línea). Agronomie 12(10):837-840. Consultado 13 jul. 2020. Disponible en https://bit.ly/3jiw16n
  3. Azcón-Aguilar, C; Cantos, M; Troncoso, A; Barea, JM. 1997. Beneficial effect of arbuscular mycorrhizas on acclimatazion of micropropagated cassava plantlets. Scientia Horticultural 72:63-71.
  4. Barea, JM. 2015. Future challenges and perspectives for applying microbial biotechnology in sustainable agriculture based on a better unders tanding of plant-microbiome interactions. Journal of Soil Science and Plant Nutrition 15(2):261-282.
  5. Calderón, L; Gómez, L; Blanco, F; Uribe, L. 2000. La inoculación con Glomus manihotis sobre el crecimiento y desarrollo de plantas de yuca producidas in vitro, en la fase de aclimatización. Agronomía Costarricense 24(2):25-29.
  6. Cano, MA. 2011. Interacción de microorganismos benéficos en plantas: micorrizas, Trichoderma spp. y Pseudomonas spp. Una revisión. Revista U.D.C.A. Actualidad & Divulgación Científica 14(2):15-31.
  7. Chalk, PM; Souza, RF; Urquiaga, S; Alves, BJR; Boddey, RM. 2006. The role of arbuscular mycorrhiza in legume symbiotic performance (en línea). Soil Biolog y and Biochemistr y 38(9):2944-2951. Consultado 11 may. 2020. Disponible en https://doi.org/bcjrwq
  8. Chikkalaki, S; Patil, SN; Venkateshalu, N. 2017. Biohardening in micropropagation. International Journal of Botany and Research 7(2):21-24.
  9. Datta, A; Singh, RK; Kumar, S; Kumar, S. 2015. An Effective and Beneficial Plant Growth Promoting Soil Bacterium “Rhizobium”: A Review. Annals of Plant Sciences 4(01):933-942.
  10. Decklerk, S; Risede, JM; Delvaux, B; 2002. Greenhouse response of micropropagated bananas inoculated with in vitro monoxenically produced arbuscular mycorrhizal fungi. Scientia Horticulturae 93(3-4):301-309.
  11. Depablos, L; Ordóñez, J; Godoy, S; Chicco, CF. 2009. Suplementación mineral proteica de novillas a pastoreo en los Llanos Centrales de Venezuela. Zootecnia Tropical 27(3):249-262.
  12. Escandón, AS; Ferreri, P; Facciuto, G; Soto, S; Hagiwara, JC; Acevedo, A. 2003. Combinación de técnicas in vitro y ex vitro para la micropropagación de panta Rita (hibr.) Una arbustiva de relevancia ornamental. RIA. Revista de Investigaciones Agropecuarias 32(1):111-112.
  13. Fernández, K; Fernández, F; González, ME; Pérez, E; Mirabal, L; Pazos, M. 2002. Micorrización in vitro de plantúlas de Coffea canephora Var. Robusta:¿Una realidad? Cultivos Tropicales 23(3):47-52.
  14. Giovannetti, M; Mosse, B. 1980. An evaluation of techniques for measuring vesicular arbuscular mycorrhizal infection in roots (en línea). New Phytologist 84:489-500. Consultado 11 may. 2020. Disponible en https://doi.org/chs76c
  15. Hewitt, EJ. 1966. Sand and Water Culture Methods Used in Study of Plant Nutrition (2 ed.). Technical communication of the Commonwealth Bureaux of Horticulture and Plantation Crops. East Malling. Maids tone, Kent. Commonwealth Agricultural Bureaux. 547 p.
  16. Krishna, H; Singh, SK; Patel, VB. 2006. Screening of arbuscular-mycorrhizal fungi for enhanced growth and survival of micropropagated grape (Vitis vinifera) plantlets. Indian Journal of Agricultural Sciences 76(5):297-301.
  17. Kumar, RK; Singh, KP; Raju, DVS. 2014. Symbiotic Effect of Arbuscular Mycorrhizal Fungi on Growth and Flowering of Micropropagated Plants of Chrysanthemum (Chrysanthemum dendranthemum) (en línea). International Journal of Bio-resource and Stress Management 5(3):369-374. Consultado 13 jul. 2020. Disponible en https://doi.org/gsnm
  18. Liriano G, R; Nuñez, BD; Barceló, R. 2012. Efecto de la aplicación de Rhizobium y Maycorrizas en el crecimiento del frijol (Phaseolus vulgaris L.) variedad CC-25-9 negro. Centro Agrícola 39(4):17-20.
  19. Lloret, L; Martínez-Romero, E. 2005. Evolución y filogenia de Rhizobium. Review. Revista Latinoamericana de Microbiología 47(1-2):43-60.
  20. López–Alcocer, JJ; Lépiz-Ildelfonso, R; González- Eguiarte, DR; Rodríguez-Macias, R; López-Alcocer, E; Olalde-Portugal, V. 2017. Caracterización morfológica y bioquímica de cepas de Rhizobium colectadas en frijol común silvestre y domesticado (en línea). Revista Fitotecnia Mexicana 40(1):73-81. Consultado 11 may. 2020. Disponible en https://doi.org/gsm4
  21. López-Falcón, R; Espinoza, F. 2015. Degradación del suelo en los llanos de Venezuela (en línea). In López Falcón, R; Hétier, JM; López Hernández, D; Schargel, R (†); Zinck, A. (eds.). Tierras Llaneras de Venezuela... tierras de buena esperanza. Consejo de Publicaciones, Universidad de Los Andes, Mérida, Venezuela. p. 269-301. Consultado 13 feb. 2020. Disponible en https://bit.ly/38gEO2f
  22. Maiquetía M, MY; Vargas C, TE; Toro G, M; García de G, EC. 2020. Estudios en la germinación y propagación in vitro de tres especies de Leguminosae: Calopogonium sp., Stylosantes capitata y Cassia moschata (en línea). Revista Científica Ecociencia 7(6):1-25. Consultado 16 feb. 2021. Disponible en https://doi.org/gsrp
  23. Marinho G, GJ; Ndiaye, A; Linhares de A, R; Azevedo E, JA. 2010. Cultivos de coberturas como indicadores de procesos ecológicos (en línea). LEISA. Revista de Agroecología 22(4):20-22. Consultado 13 jul. 2020. Disponible en https://bit.ly/2Y1jhZH
  24. Martínez-Viera, R; Dibut, B; Ríos, Y. 2010. Reseña “Efecto de la integración de aplicaciones agrícolas de biofertilizantes y fertilizantes minerales sobre las relaciones suelo-planta”. Cultivos Tropicales 31(3):27-31.
  25. Meng, L; Zhang, A; Wang, F; Han, X; Wang, D; Li, S. 2015. Arbuscular mycorrhizal fungi and rhizobium facilitate nitrogen uptake and transfer in soybean/maize intercropping system (en línea). Frontiers in Plant Science 6(339):1-10. Consultado 11 may. 2020. Disponible en https://doi.org/f7gzzt
  26. Mirjani, L; Salimi, A; Matinizadeh, M; Razavi, K; Shahbazi, M. 2019. Biotization with Glomus fasciculatum to enhance the acclimatization and absorption of nutrients by micropropagated savory (Satureja khuzistanica Jamzad) plantlets (en línea). Journal of Elementology 24(2):785-802. Consultado 13 jul. 2020. Disponible en https://dx.doi.org/gsm3
  27. Mora, E; Toro, M; López-Hernández, D. 2013. A survey of arbuscular mycorrhizae, Rhizobium and phosphate solubilizing bacteria in low fertility savanna soils in central Venezuela (Estación Experimental La Iguana). In Miransari, M. (ed). Soil Microbiology. Studium Press LLC, Houston, Texas, USA. p. 97-114.
  28. Mora, E; Toro, M; López-Hernández, D. 2017. The presence of beneficial organisms associated to N and P economy in the rhizosphere of native vegetation in an oligotrophic savanna of Guárico State, Venezuela (en línea). The Open Plant Science Journal 10:123-133. Consultado 13 jul. 2020. Disponible en https://doi.org/gsm5
  29. Mora, E; López-Hernández, D; Toro, M. 2019. Arbuscular mycorrhizae and PGPR applications in tropical savannas. In Zúñiga-Dávila, D; González-Andrés, F; Ormeño-Orrillo, E. (eds). Microbial probiotics for agricultural systems. Advances in Agronomic Use. p. 169-177.
  30. Muthuraj, K; Kaffoor, HA; Nagarajan, N. 2018. Establishment of in vitro protocol and impact of mycorrhization with phosphobacteria on micro propagated Pogostemon mollis Benth. (Lamiaceae) (en línea). Journal of Taibah University for Science 12(1):1-10. Consultado 13 jul. 2020. Disponible en https://doi.org/gsng
  31. Pérez, UA; Ramírez, MM; Zapata, YA; Córdoba, JM. 2015. Efecto de la inoculación simple y combinada con Hongos Formadores de Micorriza Arbuscular (HFMA) y Rizobacterias Promotoras de Crecimiento Vegetal (BPCV) en plántulas micropropagadas de mora (Rubus glaucus L.). Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria 16(1):95-103.
  32. Pérez, A; Trujillo, I; Vidal, MC; De Lima, N. 2006. Propagación in vitro de Stylosanthes capitata Vogel: Una especie de gran potencial forrajero. Acta Botanica Venezuelica 29(2):335-346.
  33. Phillips, JM; Hayman, DS. 1970. Improved procedures for clearing roots and staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection (en línea). Transactions of the British Mycological Society 55(1):158-161. Consultado 13 jul. 2020. Disponible en https:// doi.org/dnhtg3
  34. Poole, P; Ramachandran, V; Terpolilli, J. 2018. Rhizobia: from saprophytes to endosymbionts (en línea). Nature Reviews Microbiology 16(5):291-303. Consultado 11 may. 2020. Disponible en https://doi.org/gcwp7s
  35. Rojas-Rodríguez, F; Torres-Córdoba, G. 2015. Árboles del Valle Central de Costa Rica: reproducción Corralillo (Cassia moschata Kunth) (en línea). Revista Forestal Mesoamericana Kurú 12(29):77-79. Consultado 11 may. 2020. Disponible en https://doi.org/gsnf
  36. Rupnawar, BS; Navale, AM; 2000. Effect of VA - mycorrhizal inoculation on growth of pomegranate layers. Journal of Maharashtra Agricultural Universities 25(1):44-46.
  37. Sánchez, S; Hernández, M; Ruz, F. 2011. Alternativas de manejo de la fertilidad del suelo en ecosistemas agropecuarios. Pastos y Forrajes 34(4):375-392.
  38. Sanabria, B; Silva-Acuña, R; Oliveros, M; Manrique, U. 2004. Germinación de semillas de las leguminosas arbustivas forrajeras Cratylia argentea y Cassia moschata sometidas a inmersión en ácido sulfúrico. Bioagro 16(3):225-230.
  39. Singh, SK; Minakshi, G; Khawale, RN; Patel, VB; Krishna, H. 2004. Mycorrhization as an aid for biohardening of In vitro raised grape (Vitis vinifera L.) plantlets (en línea). Acta HortIculturae 662(1):289-295. Consultado 11 may. 2020. Disponible en https://doi.org/gsnd
  40. Singh, N; Singhb, SK; Singhb, AK; Meshrama, DT; Suroshea, SS; Mishrac, DC; 2012. Arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) induced hardening of micropropagated pomegranate (Punica granatum L.) plantlets (en línea). Scientia Hor ticulturae 136:122-127. Consultado 13 jul. 2020. Disponible en https://doi.org/gsnb
  41. Toro, M; Bazo, I; López, M. 2008. Micorrizas arbusculares y bacterias promotoras de crecimiento vegetal, biofertilizantes nativos de sistemas agrícolas bajo manejo conservacionista. Agronomía Tropical 58(3):215-221.
  42. Toro, M; Andrade, G. 2020. Arbuscular mycorrhizae, beneficial microorganisms for sustainable agricultura (en línea). In Filho W, L; Azul, A; Brandli, L; Lange, S; Wall, T. (eds). Life on land, encyclopedia of the UN sustainable development goals. p. 1-14. Consultado 13 feb. 2021. Disponible en https://doi.org/gsnc
  43. Toral, O; Machado, R; Navarro, M; Fung, C; Reino, J. 2006. Prospección y colecta de leguminosas multipropósito en la zona central de Cuba. Pastos y Forrajes 29(2):135-143.
  44. Vidal, MT; Azcón-Aguilar, C; Barea, JM; Pliego-Alfaro, F. 1992. Mycorrhizal Inoculation Enhances Growth and Development of Micropropagated Plants of Avocado (en línea). Horticultural Science 27(7):785-787. Consultado 11 may. 2020. Disponible en https://doi.org/gsm9
  45. Vosátka, M; Jansa, J; Regvar, M; Srámer, F; Malcová, R. 1999. Inoculation with mycorrhizal fungi a feasible biotechnology for horticulture. Phyton 3:219-224.
  46. Weir, BS. 2016. The current taxonomy of rhizobia. NZ Rhizobia website (en línea). Consultado 10 ago. 2020. Disponible en https://bit.ly/3Be69i8
  47. Zablowicz, RM; Tipping, EM; Lifshitz, R; Kloepper, JW. 1991. Plant growth promotion mediated by bacterial rhizosphere colonizers (en línea). In Keister, DL; Cregan, PB (eds.). The rhizosphere and plant growth. p. 315-326. Consultado 13 jul. 2020. Disponible en https://doi.org/bd4m66